1. 透射电镜基本原理 (TEM Basic Principles)
1.1 电镜诞生前的关键发现
- 1924年 — 德布罗意 (de Broglie) 提出“物质波假说”：电子具有波动性。
- 1926年 — 德国物理学家 Busch 发现电磁透镜 (electromagnetic lens)，可作为“透镜”聚焦电子束。
- 1933年 — Ernst Ruska 和 Max Knoll 发明首台电子显微镜。Ruska 获 1986年诺贝尔物理学奖。
1.2 透射电镜结构
TEM 由三大系统组成：
| 系统 |
英文 |
功能 |
| 照明系统 |
Illumination system |
电子枪 + 聚光镜，产生平行电子束 |
| 成像系统 |
Imaging system |
物镜 + 中间镜 + 投影镜，形成图像 |
| 观察系统 |
Observation system |
荧光屏 / 相机记录图像 |
1.3 透射电镜二维成像原理
TEM 的成像过程是一个两级傅里叶变换：
- 物镜后焦面 (back focal plane)：平行电子束穿过样品 → 散射电子在物镜后焦面形成衍射图 = 样品的傅里叶变换 (Fourier Transform)
- 像平面 (image plane)：衍射波继续传播 → 在像平面干涉形成图像 = 衍射图的逆傅里叶变换 (Inverse Fourier Transform)
关键概念：电镜成像是样品的二维投影 (2D projection)，像平面与后焦面互为傅里叶变换关系。
1.4 衬度传递函数 (Contrast Transfer Function, CTF)
- CTF 描述电镜对不同空间频率信号传递效率的函数。
- 在后续三维重构中需要对 CTF 进行校正 (CTF correction/estimation)。
1.5 样品制备
生物样品基本要求：
- 样品要足够薄以便电子束穿过。
- 组织/细胞：超薄切片 (ultrathin section)，厚度 < 0.5 μm。
- 蛋白：直接制样。
(a) 负染色技术 (Negative Staining)
- 用重金属盐染料（如磷钨酸、醋酸铀）对样品进行染色。
- 原理：重金属沉积在蛋白表面的染料少于碳膜表面 → 蛋白区域透过电子多→显白色，背景透过电子少→显暗色。
- 负染可提高衬度 (contrast)，但不能达到原子分辨率。
(b) 冷冻技术 (Cryo-freezing / Vitrification)
- 将样品冷冻固定在玻璃态冰 (vitreous ice) 中，在低温下观察。
- 为什么要冷冻？ → 保持样品活性状态 (near-native state)
- 为什么用玻璃态冰？ → 背景干净，减少样品损伤
- 如何获得玻璃态冰？ → 冷冻速率 > 10⁴ °C/s（即>10000°C/s）
- 关键人物：Jacques Dubochet (2017年诺贝尔化学奖)
对比记忆：负染 → 常温、高衬度、低分辨率；冷冻 → 低温、低衬度、高分辨率。
1.6 TEM 操作三大过程（考流程）
- 样品准备 (Sample preparation) — 冷冻/负染
- 电镜数据收集 (Data collection) — 低剂量成像
- 图像处理 (Image processing) — 2D → 3D 重构
1.7 TEM 在生物医学中的应用
- 生物样品质量鉴定、病毒感染诊断（如病毒表面spike蛋白分布）
- 组织切片结构研究（如骨骼肌三联管结构：T管、终末池、RyR）
- 构建/解析蛋白三维结构：2D投影 → 图像处理 → 3D重构 → 原子模型
- 分析复合物蛋白之间的作用（如剪切体 spliceosome 工作机制）
1.8 冷冻电镜三大研究技术（必考对比表）
| 技术 |
英文 |
研究对象 |
对象特点 |
典型分辨率 |
| 电子晶体学 |
Electron Crystallography |
二维晶体/管状晶体/微晶 |
周期排列/规则排列 |
0.19 nm (2D晶体) |
| 单颗粒技术 |
Single Particle Analysis (SPA) |
病毒/生物大分子 |
全同粒子 (identical particles) |
0.12 nm |
| 电子断层成像 |
Electron Tomography (ET) |
细胞器/细胞 |
单一结构 (unique structure) |
0.38 nm ~ 2 nm |
1.9 TEM 发展里程碑（时间节点题）
| 年代 |
事件 |
人物 |
| 1924 |
物质波假说 |
de Broglie |
| 1926 |
发现电磁透镜 |
Busch |
| 1933 |
首台电镜诞生 |
Ruska & Knoll |
| 1968 |
中央截面定理 (Central Section Theorem) |
Aaron Klug |
| 1970 |
首个二十面体病毒3D结构 |
Klug |
| 1982 |
诺贝尔化学奖（3D电镜） |
Klug |
| 1984 |
快速冷冻技术（玻璃态冰） |
Dubochet |
| 2012-13 |
三大突破：Titan Krios电镜 + DDD相机 + RELION软件 |
— |
| 2017 |
诺贝尔化学奖（冷冻电镜） |
Dubochet, Frank, Henderson |
1.10 2012年后的三大技术突破
Breakthrough I：Titan Krios 300kV 场发射电镜
- 三级聚光系统 → 提高电子束相干性和平行性 → 提高成像分辨率
- 12个冷冻载网盒 → 提高上样效率
- 预装载冷却装置 → 延长收集数据时间
Breakthrough II：DDD相机 (Direct Detective Device)
|
CCD相机 |
DDD相机 |
| 原理 |
电子→光信号转换（电光-光电转换） |
直接探测电子 |
| 信号 |
点扩散效应，信号损失 |
保持原始信号强度 |
| 信噪比 |
低 |
高 |
| 摄像速度 |
1幅/秒 |
40幅/秒（消除漂移） |
| 分辨率 |
低，图像模糊 |
高，图像清楚 |
- 首个近原子分辨率冷冻电镜结构：TRPV1 离子通道（3.4Å），程亦凡组 2013 Nature
Breakthrough III：RELION 软件包
- 2012年前软件（SPIDER, IMAGIC, EMAN）：按分子取向 (orientation) 分类 → 误差大
- RELION：按分子构象 (conformation) 分类 → 分类准确，分辨率提高
- 推动从静态结构生物学向动态结构生物学发展
- 被 Nature 评为2014年科学”十大进展”之一
1.11 为什么要高分辨率？
- 低分辨率 → 只能看到分子轮廓（”blob”状）
- 高分辨率 → 可分辨氨基酸侧链（如区分 Tyr/Trp/Phe）→ 构建原子模型 (atomic model)
1.12 冷冻电镜研究方向
- 研究更小分子的蛋白结构（如64kD血红蛋白，3.2Å）
- 研究更高分辨率的蛋白结构（如去铁铁蛋白 Apoferritin，1.2Å）
- 细胞原位结构研究（Cryo-ET + FIB）
2. 冷冻电镜单颗粒分析技术 (Cryo-EM Single Particle Analysis)
2.1 中央截面定理 (Central Section Theorem)
- 提出者：Aaron Klug (1968) — 1982年诺贝尔化学奖
- 内容：物体沿电子束方向二维投影的傅里叶变换等于该物体三维傅里叶变换在垂直于电子束方向的中央截面。
- 推论：三维重构需要收集不同方向的二维投影。
1
2
| 二维投影 → 傅里叶变换 → 中央截面
多个不同方向的中央截面 → 逆傅里叶变换 → 三维结构
|
2.2 辐射损伤与剂量矛盾
- 高能入射电子对生物样品造成辐射损害 (radiation damage) → 严重破坏样品结构 → 限制了电子使用剂量
- 样品需要更好衬度 → 需要高剂量电子
- SPA 的解决方案：使用高剂量只收集一次数据，通过平均同取向颗粒来提高信噪比
2.3 SPA 基本原理
- 研究对象：全同粒子 (identical particles)
- 核心假设：每个大分子结构相同；不同分子颗粒的不同取向可视为同一分子的不同取向
- 通过软件模拟计算每个颗粒的取向 → 用来重构三维模型
2.4 SPA 的五大优势
- 可使用高剂量：SPA只收集一次数据（同一颗粒被拍摄一次），在不破坏样品结构的前提下获得更高衬度
- 大幅提高信噪比：获得大量同一取向颗粒，通过平均 (averaging) 提高对比度
- 应用范围广：蛋白质、核酸、病毒等（在膜蛋白领域拥有巨大优势）
- 研究溶液中样品：更接近生理状态，可捕捉反应中间物（如时间分辨冷冻电镜）
- 可分析异质性样品 (heterogeneous samples)：多种构象、多种蛋白（甚至可直接研究菌液）
- 需要样品少：~5μg/载网 (grid)；可分析内源微量样品
- 简单快速：有纯化蛋白质样品只需要 1-2天
2.5 颗粒数目与分辨率的关系
| 目标分辨率 |
约需颗粒数 |
| 6Å |
~1,500 个 |
| 4Å |
~10⁴ 个 |
| 3Å |
~10⁵ 个 |
参考：Rosenthal (2003) JMB 333, 225-36
2.6 SPA 工作流程
数据处理具体步骤：
1
2
3
4
5
6
7
8
| 原始视频 (Raw movie)
↓ Motion Correction（漂移校正）
↓ CTF Estimation（衬度传递函数估计）
↓ Particle Picking（颗粒挑选）
↓ 2D Classification（二维分类）
↓ 3D Classification（三维分类）
↓ 3D Refinement（三维精修）
→ 三维模型 (3D Model)
|
常用软件：Relion、CryoSPARC、CisTEM
数据自动收集软件：EPU (FEI)、SerialEM — 每小时采集 >300 段视频
2.7 SPA 的限制因素
- 样品大小：>100 kDa 容易；50-100 kDa 可行；太小可通过抗体形成复合物研究
- 需要高端仪器平台（Titan Krios等）
- 异质性：需要足够的构象分类
2.8 SPA 发展历程
| 时期 |
特点 |
| 2013年前 |
低分辨率，原因：①CCD相机信号转换损失信噪比；②采样慢导致图像模糊 |
| 2013年后 |
技术革命：DDD相机 + 新算法 + RELION软件 |
DDD相机优势：直接探测电子 → 高信噪比；快速采样 40幅/秒 → 后期漂移修正 → 大幅提高分辨率
3. 冷冻电镜三维重构技术 (Cryo-EM 3D Reconstruction)
3.1 冷冻电镜四大成像方式
| 方式 |
英文 |
| 单颗粒分析 |
Single Particle Analysis (SPA) |
| 冷冻电子断层成像 |
Cryo-Electron Tomography (Cryo-ET) |
| 微晶电子衍射 |
MicroED |
| 电子晶体学 |
Electron Crystallography |
EMDB数据库中，SPA占绝对主导地位。
3.2 冷冻电子断层成像 (Cryo-ET)
发展历程
- 1993年：Baumeister 实现自动化数据采集，控制累积电子剂量在可容忍范围内
- 最初：只能研究小物体（如病毒颗粒、小型原核细胞）
- 问题：真核细胞太厚，电子穿透力有限（300kV Krios 只能穿透 < 0.5-1 μm）
- 解决方案：聚焦离子束 (FIB) 切割 — “打开进入细胞的窗口”
Cryo-ET 样品减薄方法
- Cryo-FIB/SEM：聚焦离子束+扫描电镜，在冷冻条件下对细胞进行切割减薄
- Cryo-FIB lift-out：将感兴趣区域从细胞中提取出来
- CEMOVIS (Cryo-electron microscopy of vitreous sections)：冷冻超薄切片
Cryo-ET 工作流程
1
| 铺细胞 → 冷冻细胞 → 定位(光镜/荧光) → 样品减薄(FIB) → 上样(TEM) → 数据收集
|
倾斜序列数据采集
- 样品台连续倾转：通常 ±60°（或-60°到+60°），步长 1-2°
- 电子剂量需在倾斜序列中分配（剂量分配定理，Hoppe 1976）
克劳瑟准则 (Crowther Criterion)
(Crowther, 1969)
Missing Wedge 问题
- 倾斜角只能到 ±60°~70°，无法收集完整的180°数据
- 在傅里叶空间中形成 missing wedge（数据缺失的楔形区域）
- → 导致分辨率受限，尤其在z轴方向
- 应对方法：子断层平均法 (Sub-tomogram averaging) — 从不同断层图中提取同种颗粒，平均提高分辨率
Cryo-ET 分辨率发展
- 不断改进中，从早期的几十nm到现在的亚纳米级
- 仍远低于 SPA 的单颗粒分辨率水平
Cryo-ET 应用实例
- 真实新冠病毒 (SARS-CoV-2)：2294个颗粒，获得了病毒颗粒的原位结构
- 渐冻症 (ALS)：通过Cryo-ET分析了神经细胞中 C9orf72 多聚GA聚集体 → 发现其招募并停滞蛋白酶体
3.3 微晶电子衍射 (MicroED)
- 开发者：Tamir Gonen 实验室（2013年底，HHMI Janelia Research Campus）
- 本质：电子晶体学的一种形式，使用薄3D晶体通过电子衍射确定结构
- 被 Science 评为 2018年十大技术突破之一
MicroED 特点
| 特点 |
说明 |
| 晶体尺寸 |
X射线晶体学所需尺寸的十亿分之一 |
| 工作模式 |
衍射模式 (diffraction mode)，非成像模式 |
| 电子剂量 |
极低，通常 < 0.01 e⁻/Ų/s |
| 数据采集 |
晶体持续旋转，在快速相机上作为电影 (movie) 收集 |
| 数据处理 |
使用传统X射线晶体学软件处理 |
MicroED 优势
- 提高难结晶样品结构解析成功率（晶体的十亿分之一即可）
- 显著提高共晶结构成功率（小分子浸泡共晶更容易）
- 设备要求相对较低，使用标准硬件和软件
MicroED 流程
1
| 制备微晶 (microcrystals) → 冷冻样品 → 采集衍射数据 → 数据处理及结构解析
|
（数据采集：连续旋转晶体，收集系列衍射图）
3.4 三种技术对比
|
SPA |
Cryo-ET |
MicroED |
| 优势 |
分辨率较高；丰富的生物背景；为超大柔性分子复合物带来可能 |
天然原位的生物结构 (in situ) |
分辨率高；小晶体/蛋白质晶体培养难度大大降低；小分子浸泡成功率高；设备要求较低，可实现高通量 |
| 缺点 |
分子量 > 40 kDa（太小的颗粒需特殊策略）；测试通量低；设备昂贵 |
通常分辨率低（约 10Å）；设备要求高、昂贵 |
需要 3D 晶体 |
| 适用 |
纯化的蛋白质/复合物 |
细胞/细胞器层面的原位结构 |
可结晶的蛋白质（即使是纳米晶体） |
4. 扫描电子显微镜与光电联用 (SEM & CLEM)
4.1 SEM 概述
- Scanning Electron Microscope (SEM)：用于高分辨率微区形貌分析的大型精密仪器
- 特点：景深大、分辨率高、成像直观、立体感强、放大倍数范围宽、样品可三维旋转倾斜
- 优势：几乎不损伤和污染原始样品，可同时获得形貌、结构、成分和结晶学信息
4.2 SEM 与 TEM 的结构差异
|
TEM |
SEM |
| 电子束 |
平行电子束 |
聚焦扫描电子束 |
| 成像方式 |
一次性大面积成像 |
逐点逐行扫描 |
| 信号源 |
透射电子 |
二次电子/背散射电子 |
| 样品 |
超薄切片 |
表面导电处理 |
| 关键组件 |
投影镜 |
扫描线圈 + 扫描发生器 |
4.3 SEM 结构与基本工作原理
- 电子枪发出电子 → 加速电压（通常 200V~30kV）→ 形成高速电子束
- 电磁透镜（2-3个）→ 聚成纳米尺度的束斑 → 聚焦到试样表面
- 扫描线圈控制电子束在试样表面进行逐点逐行光栅状扫描
- 高能电子束与试样相互作用 → 发射各种信号
- 探测器接收信号 → 放大器/调制解调器 → 显示器显示
关键参数：分辨率 ~ 探针尺寸（束斑直径）；需要高亮度、小束斑直径
4.4 电子束-样品相互作用
入射电子与样品作用产生的主要信号：
| 信号类型 |
英文 |
深度来源 |
主要用途 |
| 二次电子 |
Secondary Electron (SE) |
表层 5-10 nm |
表面形貌 (topography) |
| 背散射电子 |
Backscattered Electron (BSE) |
较深层 |
原子序数差异/成分 (composition) |
| 透射电子 |
Transmitted Electron |
穿透样品 |
结构信息 |
| 俄歇电子 |
Auger Electron |
最表层 |
元素分析 |
| 特征X射线 |
Characteristic X-ray |
— |
元素成分分析 |
重点：二次电子对微区表面相对于入射电子束的方向十分敏感，分辨率高，适用于形貌成像；背散射电子强度与原子序数正相关。
4.5 SE 与 BSE 的分离
- 二次电子：数目多、能量低（< 50eV）
- 背散射电子：数目少、能量高（接近入射电子能量）
- 通过加偏压或不同探测器位置分离两种信号
4.6 SEM 样品制备流程
1
| 取材 → 清洗 → 固定 → 脱水 → 干燥 → 镀膜 → 观察
|
(a) 临界点干燥 (Critical Point Drying, CPD)
- 为什么需要：普通空气干燥时，穿过液相→气相界面，表面张力会破坏样本表面微细结构
- 原理：在临界点处，液体和气体物理特性无法区分 → 不穿过液气界面 → 避免破坏
- 常用的临界点介质：
| 物质 |
临界温度 |
临界压力 |
| 水 (H₂O) |
374°C |
229 bar |
| CO₂ |
31°C |
74 bar |
实际使用 液态CO₂ 作为过渡介质（条件温和）
(b) 镀膜 (Coating)
- 原因：生物样品不导电 → 表面积累负电荷 → 二次电子发射不稳定 → 图像畸变
- 常用镀膜材料：金 (Au)、铂 (Pt)、金钯合金 (Au-Pd)、碳 (C)
- 镀层厚度：20-50 nm
- 镀膜方法：
- 真空镀膜（热蒸发）
- 离子溅射 (Ion sputtering) — 最常用
- 离子束镀膜
4.7 SEM 发展历程（时间节点题）
| 年代 |
事件 |
人物 |
| 1935 |
诞生SEM构想 |
Ruska & Knoll |
| 1938 |
在TEM上加扫描线圈，建造第一台STEM |
von Ardenne |
| 1942 |
第一台可检测厚样品的SEM，分辨率1μm |
Zworykin, Hillier, Snyder |
| 1952 |
实现 50nm 分辨率 |
Oatley & McMullan |
| 1965 |
首台商品化SEM诞生 (Stereoscan) |
Cambridge Scientific Instruments |
| 1975 |
微型计算机引入SEM，分辨率 6nm |
Amray |
| 1985 |
计算机控制的数字图像SEM |
蔡司 (Zeiss) |
| 1990 |
全面进入数字图像SEM时代 |
— |
4.8 SEM 应用实例
- NETs (Neutrophil Extracellular Traps)：SEM首次清晰展示中性粒细胞胞外诱捕网 “蜘蛛网”样结构（光滑纤维直径 15-17 nm，球状结构域直径 ~25 nm）
- HIV-1出芽 (budding)：从培养的淋巴细胞表面出芽
- 外泌体 (Exosomes)、凋亡小体、坏死小体的形态学分析
- 细胞形态学研究：药物/激素处理对细胞形态的影响
4.9 光电联用显微技术 (CLEM)
- 全称：Correlative Light and Electron Microscopy
- 定义：结合荧光显微镜 (FM) 和高分辨率电子显微镜 (EM) 的显微技术
- 核心理念：
- FM → 细胞功能信息（多色标记、活细胞动态）
- EM → 超微结构信息（纳米级分辨率）
- 关联到样品中的同一区域
CLEM 技术难点
- 同时获得高质量的电镜和光镜图片
- 实现精确的配准 (registration)
- 电镜制样过程中保留荧光信号（固定、包埋脱水破坏荧光）
- 样品在多次转移中容易受到冰污染、升温或损坏
mEosEM 突破
- 2019年，中科院生物物理所徐涛院士团队
- 开发第一个抗锇酸固定和Epon包埋的光转化荧光蛋白
- 首次实现Epon后固定电镜样品的同层超分辨光镜-电镜关联成像
Cryo-CLIEM
- 冷冻光电融合聚焦离子束系统 (cryogenic correlated light, ion and electron microscopy)
- 将激光共聚焦显微镜集成到商业化双束电镜中
- 实现双束电镜内冷冻三维多色荧光成像
4.10 成像组学 (Imageomics)
- 基因组学 (Genomics)、蛋白质组学 (Proteomics)、代谢组学 (Metabolomics) 揭示生命之剧的”演员”
- 成像组学 (Imageomics) 揭示生命之剧的”剧照”和”剧情”
- 表型组学 (Phenomics) 是生命之剧的”华章”
- NBIC (National Biomedical Imaging Center)：多模态跨尺度生物医学成像设施，北京大学
5. 跨主题综合考点
5.1 诺贝尔奖总结
| 年份 |
奖项 |
获奖者 |
贡献 |
| 1986 |
物理学奖 |
Ernst Ruska |
发明首台电子显微镜 |
| 1982 |
化学奖 |
Aaron Klug |
提出三维重构中央截面定理 |
| 2009 |
化学奖 |
— |
核糖体结构 |
| 2017 |
化学奖 |
Jacques Dubochet, Joachim Frank, Richard Henderson |
发展冷冻电镜技术 |
5.2 分辨率对比
| 技术 |
分辨率范围 |
| TEM 冷冻电镜 (SPA) |
可达 1.2 Å (原子分辨率) |
| Cryo-ET |
约 10 Å (原位结构) |
| MicroED |
可达原子分辨率 |
| SEM |
nm级 (形貌) |
| 光学显微镜 |
~200 nm (衍射极限) |
5.3 样品制备关键参数速记
| 参数 |
数值 |
| TEM 超薄切片厚度 |
< 0.5 μm |
| 玻璃态冰冷冻速率 |
> 10⁴ °C/s |
| SEM 镀膜厚度 |
20-50 nm |
| CO₂ 临界点温度/压力 |
31°C / 74 bar |
| SPA 所需蛋白量 |
~5 μg/格网 |
| 300kV 电子穿透极限 |
0.5-1 μm |
| MicroED 电子剂量 |
< 0.01 e⁻/Ų/s |
| DDD 采集速率 |
40 幅/秒 |
5.4 关键英文术语汇总
| 中文 |
英文 |
| 透射电子显微镜 |
Transmission Electron Microscope (TEM) |
| 扫描电子显微镜 |
Scanning Electron Microscope (SEM) |
| 冷冻电镜 |
Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM) |
| 单颗粒分析 |
Single Particle Analysis (SPA) |
| 电子断层成像 |
Electron Tomography (ET) |
| 微晶电子衍射 |
Micro Electron Diffraction (MicroED) |
| 光电联用 |
Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) |
| 中央截面定理 |
Central Section Theorem |
| 衬度传递函数 |
Contrast Transfer Function (CTF) |
| 直接电子探测器 |
Direct Detective Device (DDD) |
| 聚焦离子束 |
Focused Ion Beam (FIB) |
| 玻璃态冰 |
Vitreous Ice |
| 负染色 |
Negative Staining |
| 二次电子 |
Secondary Electron (SE) |
| 背散射电子 |
Backscattered Electron (BSE) |
| 临界点干燥 |
Critical Point Drying (CPD) |
| 辐射损伤 |
Radiation Damage |
| 漂移校正 |
Motion Correction |
| 三维重构/精修 |
3D Reconstruction / Refinement |
5.5 常见考试题型预测
- 简答/名词解释：CTF、中央截面定理、Missing Wedge、CPD原理、DDD与CCD区别
- 流程排序：SPA数据处理流程、SEM制样流程、Cryo-ET工作流程
- 对比填表：SPA vs Cryo-ET vs MicroED；TEM vs SEM；二次电子 vs 背散射电子
- 计算题：颗粒数-分辨率关系、Crowther准则 N = πD/d
- 论述题：冷冻电镜三大技术突破及其意义、CLEM技术难点及解决方案