质谱与结构生物学技术
目录
- [[#一、质谱蛋白质组学 Mass Spectrometry Proteomics|一、质谱蛋白质组学]]
- [[#二、X射线晶体学与结构解析 X-ray Crystallography|二、X射线晶体学与结构解析]]
- [[#三、电子显微镜技术 Electron Microscopy|三、电子显微镜技术]]
- [[#四、数学与信号处理基础 Math & Signal Processing|四、数学与信号处理基础]]
- [[#五、冷冻电镜三维重构 Cryo-EM 3D Reconstruction|五、冷冻电镜三维重构]]
- [[#六、分子互作分析技术 Molecular Interaction Analysis|六、分子互作分析技术]]
- [[#七、荧光成像 Fluorescence Imaging|七、荧光成像]]
- [[#八、对比辨析 Comparison Tables|八、对比辨析]]
- [[#术语表 Glossary|术语表]]
- [[#附录：补充讨论 Appendix|附录：补充讨论]]
一、质谱蛋白质组学 (Mass Spectrometry Proteomics)
1.1 肽段质量计算与碎裂规律
定义
质谱检测的是蛋白质酶切产物的质量。通过精确测定肽段质量和碎片离子谱图鉴定蛋白质序列及修饰。
关键要点
- 单同位素质量 (Monoisotopic Mass)：采用元素最轻、最丰富稳定同位素的精确质量计算（
¹H = 1.007825,¹²C = 12.00000），是高分辨率质谱精确质量测定的标准。 - 肽段质量计算三步：
- 将所有氨基酸残基 (Residue) 的单同位素质量相加
- 加上一分子水
H₂O(18.01056 Da)（补回肽键形成时脱去的水） - 加上质子
H⁺(1.00785 Da)，得到[M+H]⁺离子质量
- PTM 质量偏移：甲硫氨酸氧化 +15.99491 Da；半胱氨酸碘乙酰化 +58.0071 Da；磷酸化 +79.966 Da
- 碎片离子类型：b 离子（N-端）和 y 离子（C-端）最常见。CID 碎裂中 y 离子通常更丰富、更稳定。
- 碎裂是电荷导向过程：质子 (H⁺) 需位于断裂位点。脯氨酸 (P) N-端肽键易断裂；碱性氨基酸 (R, K, H) 结合质子影响碎裂模式。
[!warning] 常见误区
计算肽段质量时必须补回水分子质量并加上质子质量，初学者常遗漏其中一步。
📎 相关概念
- [[翻译后修饰]] | [[串联质谱]] | [[碰撞诱导解离]]
1.2 蛋白质组学挑战与分离技术
关键要点
- 两大核心难题：① 超高复杂性（细胞近万种蛋白，酶切后肽段数量剧增）；② 超宽动态范围（高/低丰度蛋白浓度差 > 10 个数量级）
- LC-MS 联用：HPLC 按保留时间分离肽段，进入质谱检测
- 纳升液相色谱 (Nano-LC)：内径 75μm 毛细管柱，流速 nL/min，显著提高离子化效率和灵敏度，是微量样本分析的关键技术
1.3 定量蛋白质组学方法
| 方法 | 原理 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| Label-free | 比较不同样本肽段信号强度/二级谱图数 | 操作简单 | 实验间差异大 |
| [[SILAC]] | 体内代谢标记，轻/重必需氨基酸 (K, R) 加入培养基 | 活细胞内引入标记，误差最小 | 仅适用可传代培养细胞；谱图复杂翻倍 |
| ICAT | 化学试剂标记 Cys | 首次实现同位素定量 | 只能分析含 Cys 肽段 |
| 二甲基化标记 | 甲醛 + 氰基硼氢化钠标记 N-端和 K 侧链 | 效率高、成本低 | 一级谱图复杂化 |
| iTRAQ / TMT | ==[[等重标签]] (Isobaric Tag)==：不同样本标签质量相同，LC 中共洗脱；MS/MS 碎裂产生[[报告离子]]定量 | 高通量（多至 16/18 个样本）、准确、不增加样品复杂性 | 试剂成本高 |
[!note]
iTRAQ/TMT 的核心原理：标签质量相同 → 不增加谱图复杂度；碎裂后产生质量不同的报告离子 → 报告离子强度 = 相对丰度。这是目前高通量蛋白质组学的主流方法。
📎 相关概念
- [[SILAC]] | [[等重标签]] | [[报告离子]]
1.4 [[翻译后修饰]] (PTM) 的质谱鉴定
定义
翻译后修饰 (Post-Translational Modification, PTM) 是蛋白质在翻译后发生的共价化学修饰，是细胞信号转导、基因表达调控等生命活动的核心开关。
关键要点
- 质谱是鉴定 PTM 及其精确位点的”不二选择”：修饰肽段会产生精确的质量差 (Δ)
- 磷酸化：+79.966 Da（≈ 80 Da）
- 位点定位原理：观察哪些碎片离子 (b/y) 发生了质量偏移 → 包含修饰位点的碎片离子质量 = 理论值 + Δ；不含修饰位点的碎片质量无变化 → 精准定位到特定氨基酸残基
📎 相关概念
- [[磷酸化]] | [[泛素化]] | [[乙酰化]]
二、X射线晶体学与结构解析 (X-ray Crystallography)
2.1 [[劳埃方程]] (Laue Equations)
定义
劳埃方程从三维点阵角度描述 X 射线被晶体衍射时产生衍射斑点的方向条件。与[[布拉格方程]] (2d sinθ = nλ) 完全等价，是同一物理现象的不同数学表述。
关键要点
- 三维方程组：
a·(S-S₀) = hλ,b·(S-S₀) = kλ,c·(S-S₀) = lλ - 物理意义：只有从所有原子散射的 X 射线彼此同相、相互加强时，才能形成可观测的衍射斑点 → 衍射图样是一系列分立斑点
- 与布拉格方程等价：劳埃从”三维点阵”出发，布拉格从”晶面反射”出发
2.2 [[相位问题]] (Phase Problem) 与求解
定义
X 射线衍射实验中，探测器只能记录衍射斑点强度 → 振幅 |F|，相位信息 α 完全丢失。没有相位，无法通过傅里叶逆变换计算出电子密度图。
三种相位求解方法
[[同晶置换法]] (MIR)
- 原理：在蛋白质晶体中引入重原子（Hg, Pt, Au）作为”路标”；比较原生晶体与重原子衍生晶体的衍射数据
- 核心关系：
FPH = FP + FH（矢量三角形） - 单同晶 (SIR)：两圆相交 → 两个交点 → 相位模糊
- 多同晶 (MIR)：三种及以上重原子衍生物 → 三圆唯一公共交点 → 精确相位
[[反常散射法]] (SAD/MAD)
- 原理：利用原子吸收边附近的反常散射效应（破坏 Friedel 定律对称性）
- 经典操作：引入硒代甲硫氨酸 (SelMet)，在同步辐射光源不同波长下收集数据
- SAD：单波长，存在相位模糊，需[[密度修饰]]破解 → > 70% 新结构首选
- MAD：多波长，理论上直接得到无歧义相位
- 关键：散射因子变为复数
f = f₀ + f' + i f''
[[分子置换法]] (MR)
- 原理：计算方法，”借用”已知同源结构模型的相位
- 前提：存在序列相似度 > 30% 的已知结构（PDB / AlphaFold）
- 两步搜索：① 旋转搜索（找朝向）；② 平移搜索（找位置）
- > 70% 新解析结构依赖此方法
[!warning] 常见误区
MIR/SAD 是实验方法（物理上找回相位），MR 是计算方法（数学上借用相位）。三者常组合使用。
📎 相关概念
- [[同晶置换法]] | [[反常散射法]] | [[分子置换法]] | [[相位问题]] | [[密度修饰]]
2.3 蛋白质结晶添加剂
六大类常见添加剂
- 有机溶剂与多元醇：乙醇、甲醇、MPD、1,6-己二醇（改变介电常数）
- 沉淀剂与聚合物：PEG 系列、MPD（降低溶解度，促使有序排列）
- 盐类与离子：Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺ 等二价阳离子 (1-20 mM) 稳定结构；柠檬酸根、醋酸根等阴离子降低溶解度
- 氨基酸及其衍生物：精氨酸、甘氨酸乙酯（减少聚集）
- 去垢剂与两亲性分子：β-OG 等（膜蛋白结晶关键）
- 其他：冷冻保护剂（甘油、蔗糖）、配体/辅因子（ATP, NADH）、离子液体
2.4 衍射实验流程
| 阶段 | 操作 | 关键要点 |
|---|---|---|
| 准备 | 冷冻保护 + 上样 (Loop) | 液氮低温 (~100 K)，防冰晶 |
| 数据收集 | 旋转法 (0.1°-1.0°/张) | 探测器距离 ↔ 分辨率；曝光时间平衡信号/损伤 |
| 数据处理 | ① 指标化 (Indexing) → ② 积分 (Integration) → ③ 合并缩放 (Scaling & Merging) | ` |
2.5 电子衍射 vs X 射线衍射
| 维度 | 电子衍射 | X 射线衍射 |
|---|---|---|
| 散射物体 | 原子核（库仑力极强） | 电子云（电磁波） |
| 散射强度 | 比 X 射线强 ~10,000 倍 | 极弱 |
| 样品尺寸 | 亚微米级微小晶体 | 数十微米至毫米级 |
| 散射理论 | 动力学散射（多次散射，非线性） | 运动学散射近似（单次散射，I ∝ |
| 穿透力 | 极差（< 100 nm） | 极强（毫米级） |
[!note]
根本区别不在波长，而在探针是否带电。电子带负电 → 强库仑散射 → 动力学效应。X 射线光子不带电 → 弱散射 → 运动学近似。
三、电子显微镜技术 (Electron Microscopy)
3.1 电子枪：热发射 vs [[场发射枪]]
| 特性 | 热发射型 (Thermionic) | 场发射型 (FEG) |
|---|---|---|
| 发射机制 | 热激发：加热使电子克服功函数逸出 | 量子隧穿：强电场下电子隧穿势垒 |
| 阴极材料 | 钨丝 (W) / 六硼化镧 (LaB₆) | 单晶钨针尖 |
| 工作温度 | W: ~2700 K; LaB₆: ~1500 K | 冷场: 室温; 热场 (Schottky): ~1800 K |
| 亮度 | 低 | 极高（10-1000 倍） |
| 能量散布 | W: ~2 eV; LaB₆: ~1 eV | 0.2-0.3 eV |
| 真空要求 | 10⁻⁵ mbar | 10⁻⁹-10⁻¹⁰ mbar (UHV) |
| 寿命 | W: 40-100 h; LaB₆: ~3000 h | > 10,000 h |
3.2 [[电磁透镜]] (Electromagnetic Lens)
定义
电磁透镜是电镜的核心光学元件，利用通电线圈产生的非均匀磁场汇聚电子束。通过洛伦兹力而非折射弯曲电子。
关键要点
- 核心原理：运动电荷在磁场中受洛伦兹力 → 电子做螺旋运动被聚焦
- 焦距可调：调节[[励磁电流]] → 改变磁场强度 → 连续改变焦距和放大倍数
- 构成：铜线圈 + 软磁材料 (铁壳) + 极靴 (Pole Piece)
电磁透镜的”不完美”
- [[球差]] (Spherical Aberration)：离轴越远的电子偏转越强，不汇聚在同一点。限制分辨率的核心瓶颈，需[[球差校正器]] (Cs Corrector) 解决。
- 色差 (Chromatic Aberration)：电子能量散布 → 不同能量电子聚焦位置不同。
- 像散 (Astigmatism)：磁场不完全轴对称 → 需消像散器 (Stigmator) 补偿。
- 衍射极限 (Diffraction Limit)：电子波动性决定的理论最小分辨距离。
📎 相关概念
- [[励磁电流]] | [[球差校正器]] | [[极靴]]
3.3 C1 vs C2 聚光镜
| 特性 | 第一聚光镜 (C1) | 第二聚光镜 (C2) |
|---|---|---|
| 位置 | 靠近电子枪 | 靠近样品 |
| 类型 | 强励磁（短焦距） | 弱励磁（长焦距） |
| 控制 | 束流大小（亮度/Brightness） | 照明面积（光斑尺寸/Spot Size） |
核心目的：实现照明”光斑大小”和”照明角度（会聚角）”的独立调控（解耦）。
3.4 [[背焦面]] (Back Focal Plane, BFP)
定义
背焦面是物镜后焦点所在的、垂直于光轴的虚拟平面。它不是样品的形貌像，而是样品的”衍射谱”或”傅里叶变换”平面。
关键要点
- 像平面 = 形貌像；背焦面 = 衍射平面（电子按散射角度分类汇聚）
- 物镜光阑 (Objective Aperture) 置于背焦面位置：
- 只让透射束通过 → 明场像 (BF)
- 只让特定衍射束通过 → 暗场像 (DF)
- 多束通过 → 高分辨像 (HRTEM)
- 模式切换：衍射模式 = 中间镜聚焦背焦面；成像模式 = 中间镜聚焦像平面
📎 相关概念
- [[物镜光阑]] | [[电子衍射花样]] | [[阿贝成像理论]]
3.5 正焦 / 欠焦 / 过焦
| 状态 | 励磁电流 | 图像特征 | 应用 |
|---|---|---|---|
| 正焦 (In-focus) | 恰到好处 | 边缘最锐利；生物大分子几乎看不见（相位衬度为零） | 振幅衬度样品 |
| 欠焦 (Underfocus) | ==偏小== | 边缘亮色光晕；相位信息转化为可见衬度 | Cryo-EM 数据收集核心 |
| 过焦 (Overfocus) | 偏大 | 边缘暗色光晕 | 极少使用 |
[!warning] 常见误区
冷冻电镜几乎从不在正焦下收集数据！欠焦是产生相位衬度的必要手段。
3.6 衬度 (Contrast) 与 [[衬度传递函数|CTF]]
定义
- 衬度：图像中不同区域的明暗差异。对生物大分子（轻原子），振幅衬度几乎为零，相位衬度是唯一有效途径。
- CTF (Contrast Transfer Function)：量化描述不同空间频率的结构信息在成像过程中的传递效率和相位翻转情况。
CTF 核心公式
$$\text{CTF}(\mathbf{q}) = -\sin(\chi(\mathbf{q}))$$
$$\chi(\mathbf{q}) = \pi \Delta f \lambda q^2 + \frac{\pi}{2} C_s \lambda^3 q^4$$
| CTF 取值 | 物理含义 |
|---|---|
| ` | sinχ |
| ` | sinχ |
sinχ = +1 |
正常衬度 |
sinχ = -1 |
相位翻转 (衬度反转)：”白原子”现象 |
CTF 校正策略
- 不是”除去”高频，而是”补偿”高频：频域中除以 CTF (
ρ_true = I_measured / CTF) - CTF 零点处：只能放弃该频率 → 必须拍摄不同欠焦量的多组照片互补
- 包络函数 (Envelope)：高频信号总是急剧衰减至零
3.7 CCD vs [[直接电子探测器|DED]]
| 维度 | CCD (间接探测) | DED (直接探测) |
|---|---|---|
| 探测方式 | ==间接==：电子 → 闪烁体 → 光子 → CCD | ==直接==：电子直接轰击半导体 |
| 分辨率 | 受限于闪烁体光散射 (FWHM ~30 μm) | 大幅提升 |
| DQE | 低 | 远高于 CCD |
| 读出速度 | 慢（逐行转移） | 快（像素级并行读取） |
| 计数模式 | 不支持 | 支持：单电子计数，无噪声 |
3.8 TEM 成像原理：[[阿贝成像理论]]
完整光路：电子枪 → 聚光镜 → [样品] → 物镜 → [背焦面：衍射花样] → [物镜光阑] → 物镜 → [像平面：一级放大像] → 中间镜 → 投影镜 → [荧光屏/探测器]
两次傅里叶变换：
- 样品 → 背焦面：傅里叶变换（正变换），按散射角度分离
- 背焦面 → 像平面：傅里叶逆变换（干涉合成），重建放大像
3.9 [[透射电子显微镜|TEM]] / [[扫描电子显微镜|SEM]] / [[冷冻电镜|Cryo-EM]] 关系
| 维度 | TEM | SEM | Cryo-EM |
|---|---|---|---|
| 成像原理 | 透射电子 | [[二次电子]]/[[背散射电子]] | 透射电子（低温） |
| 观察对象 | 内部结构 | 表面形貌 | 生物大分子近生理状态 |
| 样品要求 | 极薄 (< 100 nm)，干燥 | 块体，干燥，导电 | 极薄，[[玻璃态冰]]中 |
| 分辨率 | < 0.5 Å（原子级） | 1-10 nm | 2-4 Å |
[!note]
Cryo-EM 不是一台全新电镜，而是 TEM 的”低温工作模式”。
3.10 [[负染]] (Negative Staining)
定义
用重金属盐（醋酸铀酰 U, Z=92；磷钨酸 W, Z=74）包裹蛋白质，制造高散射背景 → 蛋白质在暗背景中呈现明亮的”剪影”。
关键要点
- 机制：将”弱相位物体”转变为”振幅物体” → 质量-厚度衬度
- 优点：衬度极佳、操作简单、拍照快
- 代价：分辨率限于 ~20 Å (2 nm)，无法看到原子细节
3.11 病毒为什么更适合电镜观察？
- 尺度黄金匹配：病毒 20-300 nm → 光镜盲区 (< 200 nm)，电镜主场
- 极致形态衬度：负染后形成完美剪影
- 二十面体对称性：数学红利 → 数据量降低至 1/60
- 天然稳定：外壳坚固，耐受制样和真空
- 无需标记：电镜是唯一能”看一眼”识别未知病毒的技术
四、数学与信号处理基础 (Math & Signal Processing)
4.1 [[傅里叶变换]] (Fourier Transform)
定义
将”随时间/空间变化的信号”拆解为不同频率的纯净正弦波的加权组合。
核心公式
$$F(u) = \int_{-\infty}^{\infty} f(x) \cdot e^{-i 2\pi u x} , dx$$
- 欧拉公式：
e^{-iθ} = cos(θ) - i sin(θ)→ 本质是将信号投射到复平面旋转基上 - 模长 |F(u)| = 振幅（衍射斑点亮度），幅角 φ(u) = 相位（实验中丢失）
- [[卷积定理]]：空间域卷积 = 频域乘法（CTF 校正的数学基础）
TEM 中的物理对应
| 数学概念 | 物理对应 |
|---|---|
| 空间域 f(x) | 样品平面 |
| 傅里叶变换 F(u) | 物镜背焦面（物理上实时完成 FT） |
| 模长 | F(u) |
| 相位 φ(u) | 丢失的相位信息 |
| 傅里叶逆变换 | 物镜像平面 |
| CTF | 对 F(u) 的调制权重 |
关键结论
- 分解是唯一的（数学上）——完备正交基保证
- 但实验测量不唯一——探测器只能记录
|F|²，丢失相位 - 非周期函数的 FT：数学上是无穷限积分；计算机中是截断 + 离散化的 DFT/FFT 近似
📎 相关概念
- [[傅里叶变换]] | [[卷积定理]] | [[离散傅里叶变换]] | [[快速傅里叶变换]]
4.2 调制与 CTF 的数学本质
- 空间域：
模糊图像 I = 真实结构 ρ * 点扩散函数 (PSF) - 频域：
I_FT = ρ_FT × CTF→ CTF 是 PSF 在频域的化身 - CTF 校正 = 频域除法（反滤波）：
ρ_true = I_measured / CTF
[!warning] 常见误区
“高频信息是在傅里叶变换时丢失的”——错误！高频信息是在透镜成像的物理过程中被调制的。FFT 只是呈现了被调制的样子，没有制造或删除信息。
4.3 [[中央截面定理]] (Central Slice Theorem)
定义
==一个三维物体沿某方向的二维投影的傅里叶变换，等于该物体三维傅里叶变换中，通过原点且垂直于投影方向的中心截面上的值。==
两个核心约束
- “垂直”：投影方向 ⊥ 频域截面平面
- “中央”：截面必须穿过频域原点 (F(0,0,0))，对应总质量
应用
Cryo-EM SPA 三维重构的底层逻辑 → 每张二维投影 FFT 后按角度”粘贴”入三维傅里叶体 → 填满后 IFFT → 三维密度图
五、冷冻电镜三维重构 (Cryo-EM 3D Reconstruction)
5.1 三大核心技术
| 技术 | 核心原理 | 样品 | 分辨率 | 应用 |
|---|---|---|---|---|
| [[电子晶体学]] | 收集晶体衍射或成像数据 | 必须形成晶体 | 原子级 (~1.9 Å) | 膜蛋白、[[微晶电子衍射 |
| **[[单颗粒分析 | SPA]]** | 大量结构相同颗粒成像 → 分类 → 对齐 → 平均 → 三维重构 | 高纯度、均一、大分子量 | 近原子级 (2-4 Å) |
| **[[电子断层成像 | ET]]** | 倾转样品，多角度投影 → 反投影重构 | 结构独特的细胞/细胞器 | 纳米级 (2-5 nm) |
[!note]
这三种技术不是冷冻电镜特有的，是 TEM 的通用数据采集模式。冷冻只是加了”低温防弹衣”。
5.2 [[单颗粒分析]] (SPA) 流程
- 冷冻样品（[[玻璃态冰]]中，随机取向）
- 拍摄成千上万张颗粒投影
- 每张做 FFT → 确定欧拉角 → 按[[中央截面定理]]填入三维傅里叶体
- CTF 校正 → 三维 IFFT → 蛋白质密度图
5.3 [[电子断层成像]] (ET) 重构流程
- 预处理：运动校正 → 剂量加权 → CTF 校正 → 金标精确对位（最难步骤）
- 三维重构：SIRT 迭代重构（优于 WBP）
- 缺失楔形处理：软掩模 + 各向异性分辨率报告
- [[子断层平均]] (Sub-tomogram Averaging)：切割同源颗粒 → 对齐平均 → 分辨率 nm→Å
5.4 [[缺失锥体]] (Missing Cone/Wedge)
成因
- ET：倾转极限 ±60°（极靴碰撞 +
T_eff = T₀/cosθ使高角度信号归零） - SPA：颗粒优选取向（平躺），缺少垂直方向投影
处理策略
- 软掩模：抑制振铃效应
- 各向异性分辨率报告
- 化学约束建模：键长、键角、Ramachandran 图
- 实验优化：倾斜数据收集、氧化石墨烯支持膜
[!warning] 常见误区
旋转样品台只能缓解缺失锥体，永远无法消除。
5.5 [[克劳瑟准则]] & [[电子计量分配定理]]
| 准则 | 核心问题 | 公式/思想 |
|---|---|---|
| 克劳瑟准则 | 要拍多少张？ | N = π·D/d |
| 剂量分配定理 | 剂量怎么分？ | 总剂量分散到 N 张 → 三维重构后等效 |
5.6 Beam-Image Shift & Montage ET
| 技术 | 目的 | 原理 | 代价 |
|---|---|---|---|
| Beam-Image Shift | 提升采集速度 | 电子束偏转而样品台不动 | 引入彗差 |
| Montage ET | 扩大成像视野 | 高倍拍小块 → 无缝拼接 | 总剂量增加 |
5.7 [[聚焦离子束]] (FIB) 原理
高能 Ga⁺/Xe⁺ 离子轰击 → 物理溅射 → 将冷冻细胞削薄至 200-300 nm 透明薄片 (Lamella)。
- 双束系统：FIB 垂直切割 + SEM 斜向观察
- 倾转 ±60° 限制：① 极靴碰撞；②
T_eff = T₀/cosθ信号归零
5.8 [[微晶电子衍射]] (MicroED)
定义
在 TEM 上针对微小三维晶体（< 1 μm）的结构解析技术。所需晶体比 X 射线小十亿倍。
优势 vs X 射线
- 解析速度快（可 < 1 h）、可区分绝对构型、无需同步辐射
- 互补而非替代
六、分子互作分析技术 (Molecular Interaction Analysis)
6.1 [[等温滴定量热法]] (ITC)
通过直接测量分子结合时释放/吸收的热量，定量研究分子互作的”金标准“。
- 一次实验获得：Ka/Kd, ΔH, ΔS, ΔG, n
- 无需标记；局限：样品消耗大（毫克级）
6.2 [[微量热涌动法]] (MST)
红外激光建立温度梯度 (~5K)，追踪荧光标记分子运动速度变化。
- 样品消耗极少（~10 μL，微克级）；可直接在血清/裂解液中检测
- Kd 范围极广 (pM→mM)，弱结合是其显著优势
6.3 [[表面等离子共振]] (SPR)
通过芯片金膜表面折射率变化，实时监测分子结合与解离。独门绝技：提供动力学参数 (ka, kd)。
实验流程
- 活化：EDC/NHS → NHS-酯
- 配体固定：低 pH 缓冲液中蛋白共价偶联
- 封闭：乙醇胺封闭
- 结合-解离-再生循环
传感图四阶段
基线 → 结合 (ka) → 解离 (kd) → 再生
6.4 ITC / MST / SPR 全面对比
| 维度 | ITC | MST | SPR |
|---|---|---|---|
| 原理 | 测量热量 | 热泳动速度 | 表面折射率 |
| 标记 | 无需 | 需荧光 | 无需 |
| 样品 | 高（毫克） | 极低（微克） | 中等 |
| Kd | ✓ | ✓ | ✓ |
| ka/kd | ✗ | ✗ | ✓ (独有) |
| ΔH/ΔS | ✓ (独有) | ✗ | 可间接推算 |
| 复杂体系 | 不适合 | 极佳 | 需固定 |
七、荧光成像 (Fluorescence Imaging)
7.1 [[荧光]]产生原理 (Jablonski 能级图)
- 激发：吸收高能光子 → 电子 S₀ → S₁
- 内转换 (IC)：非辐射振动弛豫
- 发射：S₁ → S₀，发射更长波长光子 → [[斯托克斯位移]]
7.2 [[系间窜跃]] / 单线态 / 三线态
| 特征 | 激发单线态 (S₁) | 激发三线态 (T₁) |
|---|---|---|
| 自旋 | ↑↓ 反平行 | ↑↑ 平行 |
| 寿命 | 纳秒 (ns) | 微秒~秒 |
| 发光 | 荧光（自旋允许） | [[磷光]]（自旋禁阻） |
- ISC：S₁ → T₁ 自旋翻转，靠自旋-轨道耦合驱动
- IC vs ISC：IC 发生在相同自旋多重态间，ISC 发生在不同自旋多重态间 → 完全不同
[!warning] 常见误区
“内转换通过系间窜跃实现”——严重错误。
八、对比辨析
8.1 成像系统全维度对比
| 维度 | 光学显微镜 | TEM | X 射线晶体学 |
|---|---|---|---|
| 是否有物镜 | 有（玻璃） | 有（电磁） | 无 |
| 获得数据 | 实空间二维图 | 实空间二维图 | 频域离散衍射点 |
| CTF 问题 | 可忽略 | 有（需校正） | 无 |
| 相位问题 | 无 | 无 | 有（核心难题） |
| 三维成像 | 需共聚焦/OPT | SPA/ET | 旋转晶体 + 傅里叶合成 |
术语表 (Glossary)
详细术语条目已输出至
PhD_Workspace/Glossary/。以下为快速索引。
| 术语 | English | 释义 |
|---|---|---|
| [[质荷比]] | m/z | 离子质量与电荷比值 |
| [[串联质谱]] | MS/MS | 选择母离子→碎裂→分析碎片 |
| [[碰撞诱导解离]] | CID | 通过碰撞使肽段碎裂 |
| [[翻译后修饰]] | PTM | 蛋白质翻译后的共价化学修饰 |
| [[等重标签]] | Isobaric Tag (iTRAQ/TMT) | 质量相同、碎裂后产生不同报告离子 |
| [[报告离子]] | Reporter Ion | iTRAQ/TMT 碎裂产生的定量离子 |
| [[劳埃方程]] | Laue Equations | X 射线衍射几何条件的三维方程 |
| [[布拉格方程]] | Bragg’s Law | 2d sinθ = nλ |
| [[相位问题]] | Phase Problem | 衍射实验丢失相位的核心难题 |
| [[同晶置换法]] | MIR | 重原子衍生物求解相位 |
| [[反常散射法]] | SAD/MAD | 利用反常散射求解相位 |
| [[分子置换法]] | MR | 借用同源结构相位 |
| [[电磁透镜]] | Electromagnetic Lens | 磁场聚焦电子束的装置 |
| [[励磁电流]] | Excitation Current | 决定磁场强度的线圈电流 |
| [[背焦面]] | Back Focal Plane | 物镜后方衍射/傅里叶变换面 |
| [[球差]] | Spherical Aberration | 离轴电子偏转更强导致的缺陷 |
| [[衬度传递函数]] | CTF | 描述空间频率信息传递效率 |
| [[直接电子探测器]] | DED | 电子直接轰击半导体的探测器 |
| [[负染]] | Negative Staining | 重金属包裹蛋白质的制样方法 |
| [[中央截面定理]] | Central Slice Theorem | 投影 FT = 三维 FT 的中心截面 |
| [[缺失锥体]] | Missing Cone/Wedge | 倾转角限制导致的频域空洞 |
| [[玻璃态冰]] | Vitreous Ice | 快速冷冻形成的无序冰 |
| [[单颗粒分析]] | SPA | 对结构相同颗粒成像平均的三维重构 |
| [[电子断层成像]] | ET | 倾转样品多角度投影重构 |
| [[子断层平均]] | Sub-tomogram Averaging | 同源颗粒对齐平均提升分辨率 |
| [[聚焦离子束]] | FIB | 离子束减薄样品的纳米加工 |
| [[克劳瑟准则]] | Crowther Criterion | N = πD/d 最少投影数 |
| [[电子计量分配定理]] | Dose Fractionation Theorem | 分散剂量仍等效的定理 |
| [[微晶电子衍射]] | MicroED | 微小晶体的电子衍射解析 |
| [[场发射枪]] | FEG | 强电场隧穿发射的高亮度电子源 |
| [[光栅扫描]] | Raster Scan | 电子束逐行往返扫描模式 |
| [[二次电子]] | SE | 样品表层激发低能电子 |
| [[背散射电子]] | BSE | 原子核弹回高能电子 |
| [[等温滴定量热法]] | ITC | 测量分子结合热量的技术 |
| [[微量热涌动法]] | MST | 温度梯度中分子运动检测 |
| [[表面等离子共振]] | SPR | 芯片表面折射率实时监测 |
| [[斯托克斯位移]] | Stokes Shift | 发射光波长 > 激发光波长 |
| [[系间窜跃]] | ISC | S₁→T₁ 自旋翻转非辐射跃迁 |
| [[荧光]] | Fluorescence | S₁→S₀ 自旋允许快速发光 |
| [[磷光]] | Phosphorescence | T₁→S₀ 自旋禁阻缓慢发光 |
| [[透射电子显微镜]] | TEM | 透射电子成像 |
| [[扫描电子显微镜]] | SEM | 扫描表面信号成像 |
| [[冷冻电镜]] | Cryo-EM | 低温 TEM 生物大分子结构解析 |
| [[电子晶体学]] | Electron Crystallography | 电子束照射晶体解析结构 |
| [[阿贝成像理论]] | Abbe Theory | 物镜两次 FT 成像原理 |
| [[卷积定理]] | Convolution Theorem | 空间域卷积 = 频域乘法 |
附录：补充讨论
A. 数学概念补充
第一类间断点
函数在某点的左极限和右极限都存在且为有限值的间断点。
- 跳跃间断点：左右极限存在但不相等
- 可去间断点：左右极限存在且相等，但不等于函数值或无定义
级数断尾效应 (Truncation Effect)
用无穷级数前有限项近似时，被舍弃尾巴（余项 R_N）的影响。
- 吉布斯现象：傅里叶级数截断在跳跃间断点附近产生 ~9% 过冲/欠冲
- 应对：误差界估计、加速收敛、最优截断
全文总结：本笔记覆盖从质谱蛋白质组学、X 射线晶体学、电子显微镜技术到分子互作分析和荧光成像的完整技术链条。核心逻辑线：识别身份（质谱）→ 解析结构（X射线/电镜）→ 理解功能（PTM/分子互作）→ 可视化定位（荧光成像）。
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质谱与结构生物学技术
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